2023年3月，北京林業(yè)大學生物學院宋躍朋教授課題組的研究成果發(fā)表在了Plant Physiology期刊上（影響因子7.4），文章題目為 “Enhanced genome-wide association reveals the role of YABBY11-NGATHA-LIKE1 in leaf serration development of Populus"的研究論文。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了楊屬YABBY11轉錄因子的結合基序和靶基因。發(fā)現YABBY11與楊樹葉形自然變異顯著關聯，為探索理想葉形遺傳改良奠定了理論基礎。

該研究發(fā)現，在毛白楊基因組中，YABBY11由于存在提前終止位點（PtoYAB11^PSC），從而導致鋅指結構域缺失，進而失去了對下游靶基因PtoNGAL-1與PtoRBCL的轉錄激活作用，使葉緣鋸齒加劇、葉面積增大、光合利用效率提升。

圖 1 楊樹自然群體葉形變異顯著

楊樹葉片形態(tài)變異豐富，在種間與種內都存在顯著的自然變異。為了闡明楊樹葉片形態(tài)自然變異的遺傳學基礎，以毛白楊與小葉楊種質資源群體為材料，發(fā)現在兩個關聯群體中，基因型-表型關聯顯著性最高的SNPs均位于YABBY11基因上。在毛白楊群體中，YABBY11具有提前終止位點（PtoYABBY11^PSC），導致與DNA結合的鋅指結構域全部丟失，僅保留了核定位信號。以YABBY11為候選基因構建系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示提前終止位點僅存在白楊派中，暗示了YABBY11^PSC可能是一個白楊派特異的基因變體。

圖 2 基于持續(xù)同調拓撲數據高通量量化的全基因組關聯分析

圖3 楊屬YABBY11基因系統(tǒng)發(fā)育樹

為闡明PtoYABBY11^PSC攜帶的提前翻譯終止位點是否改變了YABBY11下游的轉錄調控網絡，研究者利用表達數量性狀位點定位策略（eQTNs）分別對毛白楊和小葉楊群體YABBY11核酸變異與表達量進行分析。在毛白楊群體中，97個SNPs與55個基因表達量顯著關聯。在小葉楊群體中，共發(fā)現61個SNPs與52個基因形成表達量顯著關聯。靶基因功能注釋結果顯示，PtoYABBY11^PSC與PsiYABBY11下游轉錄調控網絡基因顯著不同，暗示PtoYABBY11^PSC攜帶的提前翻譯終止位點已經顯著改變了毛白楊YABBY11下游的轉錄調控網絡。

圖 4 PsiYABBY11基因通過順式作用元件與下游靶基因相互作用

使用DAP-seq技術，對具有完整轉錄因子結構的PsiYABBY11下游靶基因進行篩選，在164個基因上共篩選到220個PsiYABBY11互作位點，其中37.5%的互作位點位于轉錄起始位點上游2000 bp范圍內。對PsiYABBY11下游靶基因進行KEGG通路注釋，PsiYABBY11的下游靶基因主要富集在photosynthesis, oxidative phosphorylation, starch and sucrose metabolism, 以及 ribosome等通路中。聯合eQTNs與DAP-seq分析結果，共篩選出NGAL1, RBCL, PHOTOSYSTEM II REACTION CENTER PROTEIN B (PSBB), ATP SYNTHASE SUBUNIT ALPHA (ATPA)以及ATP SYNTHASE EPSILON CHAIN (ATPE) 基因為PsiYABBY11的下游靶基因。酵母單雜交與EMSA實驗進一步驗證了PsiYABBY11可以和NGAL1 與RBCL基因的啟動子直接結合。雙熒光素酶實驗結果表明PsiYABBY11能夠激活NGAL1 與RBCL基因表達。酵母單雜實驗結果進一步證明了NGAL1與其下游生長素響應靶基因CUC2也存在相互作用。該結果表明，YABBY11-NGAL1-CUC2 可能通過調控楊樹葉邊緣發(fā)育進而導致葉片形態(tài)的自然變異。

圖 5 PsiYABBY11與PtoYABBY11^PSC分子功能解析

在PtoYABBY11^PSC與PsiYABBY11的過表達株系中， PtoYABBY11^PSC-OE植株葉長、葉寬、葉面積顯著增加，光合作用效率顯著提升，葉片邊緣鋸齒顯著加劇。PtoYABBY11^PSC-OE植株葉長、葉寬、葉面積顯著減小，光合作用效率降低，葉片邊緣光滑，但是葉脈厚度與氣孔密度顯著增加。 PtoYAB11^PSC-KO的基因敲除突變植株葉片邊緣光滑，但是光合作用效率與葉片面積沒有顯著改變。

圖 6 楊屬YABBY11調控葉形自然變異的分子機制

以上研究結果表明， YABBY11激活NGAL1的表達，進而抑制CUC2基因表達，調控光滑葉緣的形態(tài)發(fā)育。同時，YABBY11 激活RBCL基因表達，導致Rubisco大小亞基裝配失調，進而光合作用效率下降。而在白楊派樹種中，YABBY11^PSC由于攜帶翻譯提前終止位點，喪失了對NGAL1-CUC2模塊以及RBCL基因的轉錄調控作用，進而導致葉片面積增大、葉片鋸齒加劇、光合作用效率提升。此外，YABBY11在毛白楊與小葉楊中均對脅迫信號響應敏感，暗示了YABBY11-NGAL1-CUC2可能是基因組與環(huán)境信號互作調控葉形變異的關鍵分子調控模塊。該模塊為系統(tǒng)了解葉形響應外界環(huán)境信號產生自然變異提供了一個全新的視角，為探索理想葉形遺傳改良奠定了理論基礎。